Aufreinigung

Aufreinigung (engl. downstream processing) umfasst alle koordinierten Prozesse, die nach der Fermentation in biotechnologischen Verfahren durchgeführt werden. Die Aufreinigung umfasst viele Verfahren zur Trennung und Reinigung des Zielmoleküls (target molecule). Das Ziel ist es, das gewünschte Produkt aus der Fermentationsbrühe zu trennen.

Die Aufreinigung wird in der Regel in zwei Phasen (Abschnitte) unterteilt: Isolierung und Reinigung.

Die Phase "Isolierung" folgt unmittelbar auf die Ernte des Rohmaterials. Bei der Isolierung wird das Rohmaterial (Fermenterbrühe) zu einem geklärten Zufuhrstrom verfeinert, d. h. zu einem Prozesszwischenprodukt, das frei von Zellen und anderen Partikeln ist. Die im Isolierungsschritt eingesetzten Arbeitsschritte hängen stark vom ursprünglichen Rohmaterial ab. Einige biologische Materialien erfordern nur eine begrenzte Zentrifugation oder Filtration.

In der Phase "Reinigung" besteht das Ziel darin, aus dem geklärten Einsatzmaterial ein reines biopharmazeutisches Produkt herzustellen. In der Aufreinigung ist dies ist die teuerste Phase, da es notwendig ist, das gewünschte Produkt von anderen Molekülen mit ähnlichen Eigenschaften zu trennen.

Bei "Isolierung" wird häufig die Filtration zur Entfernung von Partikeln eingesetzt.

Trennung über Dichteunterschiede: Ein in einem flüssigen Medium geringerer Dichte schwebendes Teilchen neigt aufgrund der Schwerkraft zur Sedimentation. Der Abwärtsbewegung entgegen wirkt die Kraft des Auftriebs, die dem Gewicht der verdrängten Flüssigkeit entspricht. Dem Auftrieb entgegen wirkt die Reibung zwischen den Partikeln und der Flüssigkeit sowie in gewissem Umfang die Diffusion.

Partikel, deren Auftriebskraft die nach unten wirkende Gravitationskraft übersteigt, neigen dazu, an die Oberfläche zu steigen und zu schwimmen. Die Schwerkrafttrennung kann daher verwendet werden, um schwere Partikel zu sedimentieren und schwimmfähige Partikel in den Überstand zu bringen, wobei eine teilweise geklärte Flüssigkeitsschicht zurückbleibt. Die Schwerkrafttrennung kann in einem Tank erfolgen. Die Methode ist bei grossen Partikeln schnell und effizient, aber (zu) langsam und ineffizient, wenn die Partikel kleiner werden. Die Methode eignet sich daher nur für grobe Trennschritte. Eine effizientere Schwerkrafttrennung kann mit einem Teller-Separator erreicht werden, der aus einer Reihe von gleichmässig beabstandeten Platten besteht, die in der Regel in einem Winkel geneigt sind, um eine grössere Absetzfläche auf kleinerem Raum zu bieten.

Zentrifugation

Die Zentrifugation ist ein mechanischer Prozess, bei dem eine Zentrifugalkraft anstelle der Schwerkraft genutzt wird, um die Komponenten einer Mischung nach Dichte und / oder Partikelgrösse zu trennen. Es handelt sich um eine weit verbreitete Einheitsoperation. Die Zentrifugation im Labor ist ein einfacher, sicherer Trennschritt, allerdings im Chargenbetrieb. Bei grosstechnischen Verfahren in der Regel Durchlaufzentrifugen eingesetzt, bei denen das Aufgabegut kontinuierlich einem sich drehenden Rotor zugeführt und der Überstand kontinuierlich abgeführt werden.

Filtration

Die Filtration wird in vielen verschiedenen Phasen der Verarbeitung sowohl während der Isolieurng als auch der Reinigung angewendet. Die Membranfiltration wird häufig in biotechnologischen Herstellungsprozessen eingesetzt, da sie bei relativ niedrigen Temperaturen und Drücken arbeitet und keine Phasenänderungen oder chemische Zusätze erfordert. Filtrationsprozesse verursachen nur eine minimale Denaturierung, Deaktivierung oder Degradation labiler Proteine.

Flüssig-Flüssig-Extraktion, Fällung

Bei der Extraktion werden eine oder mehrere Komponenten einer Mischung von einer Phase in eine andere überführt, während bei der Fällung eine oder mehrere Komponenten aus einer Lösung entfernt werden, um eine feste Phase (den Niederschlag) zu bilden. Dies sind einige der einfachsten und kostengünstigsten Fraktionierungsmethoden, da sie durch Zugabe oder Entfernung von Salz, organischen Lösungsmitteln oder durch Änderungen der Temperatur und des pH-Werts erreicht werden können. Die Flüssig-Flüssig-Extraktion unter Verwendung organischer und wässriger Extraktionsmedien ist ein traditionelles Trennverfahren, das zur Reinigung von Biopharmazeutika eingesetzt werden kann. Bei der Dreiphasentrennung können Proteine direkt aus Zellhomogenaten durch Trennung zwischen einer Butanolschicht und einer starken wässrigen Salzlösung gereinigt werden. Unter diesen Bedingungen neigen Zelltrümmer dazu, sich in die organische Phase zu trennen und Nukleinsäuren fallen an der Grenzfläche aus, während Proteine in Lösung bleiben.

Proteinfällung

Die Proteinfällung ist ein etablierter Prozess. Unter milden Bedingungen ist die Proteinfällung reversibel und die anschliessende erneute Auflösung stellt die Gesamtaktivität wieder her. Die Proteinfällung kann entweder ein Produktisolierungsschritt oder ein Reinigungsschritt sein. Im ersten Fall wird durch den Niederschlag und die anschliessende erneute Auflösung in einer kleineren Wassermenge nicht nur das Verarbeitungsvolumen reduziert, sondern die entstehende Lösung enthält auch hauptsächlich gelöstes Protein, das frei von anderen löslichen Verunreinigungen ist. Im letzteren Fall kann die unterschiedliche Löslichkeit von Proteinen zur Fraktionierung genutzt werden. Proteine können durch Änderung des pH-Werts oder der Temperatur oder durch Zugabe eines milden organischen Lösungsmittels, eines Salzes, eines mehrwertigen Metallions oder eines nichtionischen Polymers ausgefällt werden. Die gewählte Fällungsmethode hängt davon ab, ob das gebildete Proteinpräzipitat ohne Aktivitätsverlust wieder aufgelöst werden kann, von den Kosten des Fällungsmittels und seiner Rückgewinnung sowie von den Auswirkungen von Verunreinigungen des Fällungsmittels im Präzipitat.

Aussalzen

Eine hohe Salzkonzentration fördert die Proteinaggregation und -ausfällung. Es wird angenommen, dass das Salz das Wasser der Lösung aus dem Protein entfernt und dadurch die Proteinlöslichkeit verringert. Die Hofmeister-Reihe steht für abnehmende Anioneneffektivität: Citrat › Phosphat > Sulfat > Acetat > Chlorid > Nitrat > Thiocyanat. Die Salze am unteren Ende dieser Reihe verursachen strukturelle Schäden an Proteinen. Die hohe Löslichkeit von Ammoniumsulfat in Wasser und die Position von Sulfat in der Hofmeister-Reihe machen es zur beliebtesten Wahl für das Aussalzen von Proteinen.

pH-Änderungen

Proteine sind in Wasser löslich, da ihre geladenen Gruppen mit ionisierten Wassermolekülen interagieren. Durch die Anpassung des pH-Werts an den pl wird die Löslichkeit minimiert, da die Nettoladung des Proteins eliminiert wird. Die meisten Proteine haben einen pl < 7, und die relativ niedrigen Kosten von Säuren machen die pH-Anpassung mit Säure zu einer beliebten Methode zur Proteinfällung. Zu viel Säure oder Base kann jedoch zu einer irreversiblen Denaturierung führen.

Organische Lösungsmittel

Durch die Zugabe eines milden organischen Lösungsmittels zu einer wässrigen Proteinlösung wird die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels verringert, wodurch eine Proteinfällung induziert wird. Das Lösungsmittel muss vollständig mit Wasser mischbar sein (z. B. Ethanol und Aceton). Die Lösungsmittelfällung wird in der Regel bei niedrigen Temperaturen (<10 °C) durchgeführt, da die Konformationssteifigkeit dann eine irreversible Denaturierung verhindert.

Temperatur

Proteine fallen bei Temperaturerhöhung unterschiedlich schnell aus und denaturieren unterschiedlich schnell. Einige robuste Proteine sind jedoch gegen Hitzedenaturierung resistent. Daher kann durch das Aussetzen einer unreinen Mischung einer erhöhten Temperatur über einen angemessenen Zeitraum ein Protein in Lösung gereinigt werden, und zwar aufgrund der irreversiblen Denaturierung und Ausfällung der Verunreinigungen.

Polymere und Polyelektrolyte

Nichtionische, wasserlösliche Polymere induzieren eine Proteinfällung, indem sie Wasser aus der Solvatisierungsstruktur eines Proteins ausschliessen. PEG (Polyethylenglykol) ist das am häufigsten untersuchte und verwendete Polymer. Polyethylenglykol (PEG) ist ein synthetisches, wasserlösliches Polymer, das durch die Polymerisation von Ethylenglykol hergestellt wird. Aber auch Dextrane werden für diesen Zweck eingesetzt. Die Wirkung von Polymeren als Fällungsmittel ähnelt der Verteilung in wässrigen Zweiphasen-Polymersystemen. Hohe PEG-Konzentrationen sind erforderlich, um Proteine mit niedrigem Molekulargewicht auszufällen, während niedrige Konzentrationen für Proteine mit hohem Molekulargewicht erforderlich sind. Polyelektrolyte wie Caprylsäure, Polyacrylsäure, Carboxymethylcellulose und Polyethylenimine fällen Proteine bei einer viel geringeren Konzentration (normalerweise <0,1 %) aus als nicht-ionische Polymere. Sie wirken eher wie Flockungsmittel und adsorbieren an das Protein. Daher fällen Polyelektrolyte im Gegensatz zu PEG zusammen mit dem Protein aus und können eine irreversible Denaturierung verursachen.